La mutagenesi sito specifica è una tecnica usata per:
- creare specifiche alterazioni in un gene
- studiare la relazione tra struttura delle proteine e la sua funzione
- modificare o riparare costrutti di DNA
- alterare siti di restrizione, inserire o eliminare elementi di un vettore ( per esempio elementi tag, o scambio di promotori)
- Possiamo introdurre ogni tipo di mutazione singola o multipla* (sostituzione, inserzione o delezione) in plasmidi fino a 15kb.
Si sconsiglia l’uso di plasmidi più grandi (>15 kb, lentivirali...), low copy, o con sequenze molto ripetute o ricchi in GC perchè potrebbero riarrangiare facilmente o essere poco efficienti nella replicazioni . In questi casi contattare il laboratorio scrivendo a Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

IL SERVIZIO COMPRENDE:
- sequenziamento con oligo senso della porzione da mutagenizzare per confermare il DNA prima della mutagenesi
- disegno e sintesi dell'oligo mutagenizzante
- amplificazione del DNA
- trasformazione, cultura cellulare e purificazione di 5 colonie random
- sequenziamento dei cloni purificati per confermare la mutazione
- 4/5 giorni lavorativi per singola mutazione
- invio dell’allineamento con la sequenza di controllo wt e singolo elettroferogramma del clone positivo
- invio di 1/4µg di DNA plasmidico mutato purificato

SU RICHIESTA:
- sequenziamento dell'intero inserto o del plasmide con sintesi dei relativi oligo che verranno conservati nella Banca Oligo personale
- controllo del plasmide tramite digestione con enzimi di restrizione
- preparazione maggiore di DNA plasmidico purificato (midi o maxi)
- sequenziamento del sito da mutagenizzare e del clone positivo anche con oligo anti-senso.

Si fa notare che il compimento di tutti i controlli di qualità previsti, pur non garantendo il funzionamento del clone, daranno comunque diritto alla Bio-Fab a ricevere il pagamento concordato fino alla fase del progetto svolto.

MATERIALE DA SPEDIRE IN LABORATORIO:
- 3-4 µg di plasmide purificato contenente il DNA che deve essere mutato, proveniente da un ceppo di E.coli dam+. Il DNA va spottato su carta 3MM ed essiccato. I plasmidi isolati da ceppi dam- non sono idonei (per es. jm110, scs110 e BL21)
- mappa del plasmide con indicazione della resistenza all'antibiotico e sequenza del DNA target
- istruzioni sulla mutagenesi: lista e localizzazione delle basi per inserzione, delezione e sostituzione
- form compilato in ogni sua parte

*per il costo delle mutazioni multiple contattare Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

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