Il termine microbioma, coniato da Lederberg e McCray come "... la comunità ecologica di microrganismi commensali, simbiotici e patogeni che condividono letteralmente il nostro spazio corporeo”, riunisce un numero notevole di discipline con l'obiettivo generale di comprendere e infine sfruttare il funzionamento dei sistemi microbici. Il microbioma umano continua ad essere intensamente studiato, ma campioni microbici sono stati raccolti da quasi ogni habitat immaginabile sulla Terra, dall'atmosfera superiore al sottosuolo dei fondali marini, dalle sorgenti calde al ghiaccio dei ghiacciai, dalle grotte ai nostri monumenti italiani, e dalle viscere dei nematodi alle carcasse di balene.

L’analisi del microbioma fa uso di un insieme di strumenti; un flusso di lavoro comune per l’analisi del microbioma è simile al seguente: campionamento (ad es. terreno, acqua, feci), conversione di rRNA in DNA o estrazione del DNA, sequenziamento del DNA e analisi bioinformatica per descrivere importanti proprietà del microbioma. Questa pipeline è applicata a un gran numero di campioni da una vasta gamma di ambienti. Distinguiamo un approccio di sequenziamento mirato mediante l’uso della reazione a catena della polimerasi (PCR) di “geni marker", anche conosciuto come amplicon squencing e un approccio di shotgun metagenomica.

Caratterizzazione del microbioma procariotico usando il gene rRNA 16S

Il cavallo di battaglia dello studio della diversità microbica è stato finora il gene dell'RNA ribosomiale 16S, che è stato oggetto di un intenso sviluppo di protocolli: vedi ad esempio Earth Microbiome Project (EMP) e di una valutazione dettagliata del sequenziamento 16S su Piattaforme di sequenziamento Illumina (MiSeq). Tuttavia, pur catturando la composizione tassonomica di una comunità microbica, il sequenziamento di geni maker è limitato nella sua capacità di rivelare la diversità delle funzioni presenti, che richiede invece l'applicazione di approcci alternativi.

Ottenere un quadro accurato e pertinente del microbioma richiede un’attenta progettazione sperimentale, le procedure di campionamento esenti da contaminazioni involontarie possono essere estremamente complesse. Altri metodi "meta-omici" che considerano trascritti di RNA messaggero possono rivelare molto altro sulle attività microbiche in un habitat particolare. La combinazione di più strategie possono essere particolarmente potenti, il sequenziamento metagenomico può riguardare la costruzione di librerie da marcatori a singolo gene (ad es. geni dell'rRNA 16S), ma anche la costruzione di librerie di interi genomi microbici, fornendo informazioni anche sul potenziale funzionale del microbioma in studio.

Inoltre, BioFab offre servizi dedicati ai ricercatori che desiderano sequenziare e analizzare metagenomi virali (viromi) da campioni ambientali e clinici.

Caratterizzazione del microbioma eucariotico usando il gene rRNA 18S

Il profilo tassonomico di comunità microbiche complesse attraverso geni marcatori dell’rRNA 16S ha riscosso un ampio interesse, scoprendo una vasta gamma di informazioni sulla composizione batterica delle comunità microbiche, nonché la loro associazione con lo stato di salute e malattia. D'altra parte, poco si sa riguardo ai componenti eucariotici dei microbiomi. Tali componenti includono parassiti monocellulari e vermi multicellulari che sono noti per avere un impatto negativo sulla salute di milioni di persone in tutto il mondo. Gli attuali metodi molecolari per rilevare la diversità dei microbi eucariotici in un campione si basano sul sequenziamento di ampliconi di regioni ipervariabili nel gene eucariotico rRNA 18S.

Come per il gene dell'rRNA 16S utilizzato per il rilevamento di taxa batterici, il gene dell'rRNA 18S è un marcatore adatto per gli eucarioti, per la presenza di regioni genetiche conservate adatte per disegnare primer universali, separate da regioni variabili relativamente corte, che servono come codici a barre per identificare di taxa specifici. Inoltre, il gene 18S ha una ampia serie curata manualmente di sequenze di riferimento disponibili, essenziale per un'accurata classificazione tassonomica.

Le attuali raccomandazioni includono l'uso della regione variabile 18S 4 per un'ampia risoluzione tassonomica, proposta dal Consortium for the Barcode of Life (CBOL | iBOL), e la regione variabile 18S 9 proposta da Earth Microbiome Project (EMP). Tuttavia, l'adozione del gene 18S rRNA come adatto marcatore deve affrontare una serie di sfide sperimentali e computazionali. Ad esempio, le differenze nella composizione della parete cellulare o della membrana possono influenzare le procedure di estrazione, distorcendo il recupero di alcuni taxa. Le regioni di DNA conservate utilizzate per il legame con il primer possono non essere identiche al 100% tra i taxa con conseguenti mismatch dei primer e conseguenti distorsioni nelle reazioni di generazione degli ampliconi. In termini di classificazione tassonomica, la variabilità della sequenza specifica della linea evolutiva può influire in modo significativo sul livello al quale i diversi taxa possono essere risolti. Mentre una specifica regione variabile può essere abbastanza ionformativa per differenziare generi o specie in una line evolutiva, può essere relativamente più conservata in un altra, consentendo solo un'assegnazione tassonomica ad un livello piu’ alto (ad esempio, ordine o famiglia). Pertanto, potrebbero essere necessarie ulteriori regioni genetiche come marcatori per risolvere generi o specie in particolari gruppi tassonomici.

Altri biomarcatori genetici negli eucarioti comprendono la subunità ribosomiale grande e gli Internal Transcribed Spacer (ITS), la citocromo ossidasi mitocondriale I, le proteine nucleari actina e alfa-/beta-tubulina, miosine, Hsp70 e altre. Tuttavia, ad oggi, i confronti sistematici per valutare questi geni marker sono dipendenti dai database di riferimento.

Specifiche del servizio BioFab:

1. Amplificazione delle regioni variabili partendo da DNA (estratto da suolo, feci o cibo)
2. Barcoding con index Illumina
3. Sequenziamento su piattaforma Illumina con corsa paired-end 2X300
4. Profondità della lettura: 100.000 reads sequenziate
5. Consegna dei dati di sequenziamento e dell’analisi bioinformatica "base" o "avanzata"